2021年（nián），經濟合（hé）作與發展組織（OECD）正式發布了一項具有裏程碑意義的測試指南——第497號（hào）（TG 497），首次將一套完整的綜合（hé）體外（wài）測試方案納入國際毒（dú）理學評價體（tǐ）係，該方案用於化學品的皮膚致敏性評估，被（bèi）視為可完（wán）全替（tì）代（dài）動物實（shí）驗。緊接著，OECD於2022年又發布了（le）另一項綜合體外測試方案（àn）TG 467，用於（yú）評估眼（yǎn）部腐（fǔ）蝕與刺激（jī）。盡管目（mù）前僅有這兩項指（zhǐ）南作為完全替代相應動物實驗（yàn）的方案被納入官方毒理測試評價體係，但它們的（de）推出仍標誌著在部分領域，非動物（wù）方法已由（yóu）“輔助性工具”躍升為決策層麵的主導（dǎo）手段，實現了特定毒理終點的（de）完全替代（dài）。但正如TG 497的成功案例所揭示的那樣，實現“完全替代”的道路並非（fēi）坦（tǎn）途——每一（yī）個（gè）被采納的替代方案都需要在對生物機製深入理解的基礎上，實現方法的標準化、完成多中心驗證及確保替代方案與人體真實反應的高度一致性。因此，目前替代（dài）成功更多是個別突破而（ér）非普遍現（xiàn）象。在了（le）解TG 497前，先（xiān）簡要了（le）解下皮膚致（zhì）敏的過程和機理：化合物（wù）引（yǐn）發皮膚致敏反應主要涉及三個連續的生物學過程。

首先（xiān），多數低分子質量（通常小於500道爾頓）的化學物質本身不能被免（miǎn）疫係統直接識別，因此它（tā）們需首先與皮膚中的蛋白質發生共價結合，形成所謂的半抗原複合物。這（zhè）種修飾後的蛋白質結構被免疫係（xì）統識別為“外來”，成（chéng）為真正具有免疫原性的抗原，進而觸發（fā）遲發型（IV型）變態反應（yīng），即皮膚（fū）致敏反應的起點；

第二步是角質形（xíng）成細胞的應激激（jī）活。在接觸化學物質後，表皮中的角質形成細（xì）胞會被（bèi）刺激而激活，釋放一係列促炎因子（zǐ），如各（gè）種白細胞介素（sù）和胸腺基（jī）質淋巴細胞生成素等。這些細（xì）胞因子的釋放不僅增強局部炎症反應（yīng），還具有重要的免疫信號功能（néng），可吸引並激（jī）活樹突狀細胞及朗格漢斯細胞向接觸部位遷（qiān）移；

第三步是樹突狀（zhuàng）細胞（bāo）的激（jī）活與（yǔ）抗原提呈。這些抗原遞呈細胞在接（jiē）觸刺（cì）激（jī）部位攝取半抗原複合（hé）物後，成熟並遷移至區（qū）域性淋巴結（jié），在（zài）那裏與T細胞相互作用，完成抗（kàng）原提呈，最終形成免疫記憶。該免疫記（jì）憶使（shǐ）得個體（tǐ）在後續暴露相同（tóng）化學物質時迅速出現過敏（mǐn）反應，表現為典型的過（guò）敏性接觸性皮炎。

從（cóng）皮膚首次接觸某種化學物質，到（dào）反複暴露後誘發過（guò）敏性接觸性皮炎的（de）全過程，在現代毒理（lǐ）學中被統稱（chēng）為（wéi）“有（yǒu）害結局通路”。該通路由多（duō）個生物學過程構成，其中的關鍵環節被稱為“關鍵事件”。由上文可（kě）知，皮膚致敏的有（yǒu）害結局通路包含三個關鍵事件，即（1）半抗原形成；（2）角質形成（chéng）細胞的激活和（3）樹（shù）突狀（zhuàng）細胞激活。在所有已知的“有害（hài）結（jié）局通路”中（zhōng），皮膚致敏性“有害結局通路”是建立最早、機（jī）製最明（míng）確，且相（xiàng）對容易進行體外（wài）模擬的免疫反應，因此成為了替代方法開發的突破口。

在傳（chuán）統毒理學評估中，皮膚致敏性通常依賴動物整體反（fǎn）應模型進行判斷，代（dài）表性方法包括：（1）豚鼠皮膚致敏試驗，用於綜合評估致敏起始階段與激發階段（duàn）的反應；（2）局部（bù）淋巴結試驗，聚焦於皮膚致敏階段。以局部淋巴結試驗為例，一次標準實驗需消耗至少20隻小鼠。據統計，截至2018年，僅（jǐn）在歐盟REACH製度實施框架下就已有超過33,000隻小鼠被（bèi）用於皮膚致敏性測試。

那麽TG 497中所列的動（dòng）物替代技術是（shì）如何實現的（de）呢？TG 497 所采用的“三選二策略”是基於皮（pí）膚致敏性有害結局通路中的前三個關鍵事件所構建的一種（zhǒng）綜合性評估方法，旨在判（pàn）定受試化學物是否具有（yǒu）皮膚致（zhì）敏潛力。

首先，直接肽反應實（shí）驗（DPRA，OECD TG 442C）用於評估第（dì）一關鍵事件，即被測物是否具有（yǒu）與蛋白質共價結合形成半抗原（yuán）的能力。該方法采用合成的含半胱氨酸或賴氨酸殘基的肽段作為模型受體，與被測（cè）物共同孵育後（hòu），通過測量肽的消耗（hào）率評估其反應性。反應結束後，利用（yòng）高效液相色譜對肽段殘留量（liàng）進行定（dìng）量分析。若肽的消耗顯著，說明（míng）化學物能與肽發生共價反應，具備潛在致敏性，從而完成對半抗原形（xíng）成關鍵事（shì）件的評（píng）價。

其次，角質形成細（xì）胞激活試驗（KeratinoSens™, OECD TG 442D）用於（yú）評估第二關鍵事件（jiàn）——角質形成細胞的氧化應激與促炎反應激活，該事件在有害結局通路中處於（yú）信號放大的早期階段。KeratinoSens™方法基於轉基因人永生化角質形成細胞係HaCaT，該（gāi）細胞穩定表（biǎo）達一個由抗（kàng）氧化反應（yīng）元件驅動的熒光素酶報（bào）告基因。當潛在致敏（mǐn）物質刺激角質（zhì）形成細胞時（shí），會引（yǐn）發細胞內應激響應，從而啟動（dòng）熒光素酶表達。通過測定熒光素酶活性，即可定量評估化學物對該（gāi）通路的激活能力，進而判斷其是否誘導角（jiǎo）質形成細胞釋放促（cù）炎因子。

最後，人源樹突狀細胞活化實驗（h-CLAT，OECD TG 442E）模擬有害結局通路中的第三關鍵事件——樹突狀細胞的（de）激活。在致敏過程中，被測物通過局部炎症信號激活樹突狀細胞，後者在（zài）抗原識別（bié）、處理（lǐ）及向T細胞提（tí）呈抗原（yuán）的過程中起到橋梁作用。h-CLAT方法使用人急性單核細胞白血病（bìng）細胞係THP-1作為樹突（tū）狀細（xì）胞的替代模型。當致敏化學物作用於THP-1細胞後（hòu），若具免（miǎn）疫激活（huó）能力，將誘導其表麵共刺激分子（如CD86和CD54）表達上調。通過流（liú）式細胞分析檢測這些表麵標誌（zhì）物的相對熒光強度變化，即可判斷化學物是否具備激活免疫係統的潛能。

TG 497通過整合（hé）上述三種機製互補的體外方法，從生物學不同層麵綜合評估皮膚致敏性（xìng）。隻要（yào）任意（yì）兩項測試結（jié）果一致，即可做出科學、可靠的致敏性判（pàn）斷，從而實現在此毒理終點上對動物實驗的完全（quán）替代。這（zhè）三項方法各自針（zhēn）對皮膚致敏有害結局通路中的不同關鍵節點，組合使用時增強了判斷的穩健性和預測一致性。

TG 497被正式寫入OECD指南（nán）前，其開發（fā）團隊以及歐盟替代方法驗證中心（xīn）、美國替代方法驗證協調委員會和日本替代方法驗證中心都對其（qí）評估能力進行了驗（yàn）證，並與傳統動物實驗方法如局部淋巴結試驗做（zuò）了對比，結果顯示TG 497在多個核心指（zhǐ）標上全麵優於局部淋巴結試驗。具體表現為：在敏感性上，TG 497達到了87%，相比之下局部淋巴結（jié）試驗為72%，證明前者（zhě）在（zài）識別真（zhēn）正致敏物方麵表現更優；在特異性方麵，TG 497為88%，也明顯高於局部淋巴結試驗的75%，證明其在排除非致敏物時誤判更少；在準確（què）率上，TG 497為87.5%，也高於局部淋巴結試（shì）驗的73%，證明其在整體預（yù）測效能上表現更加平衡；更為關鍵的是，與人體不良反應數據（jù）的一致性上TG 497達到了“非常高（gāo）”，而局（jú）部淋巴結（jié）試驗僅為（wéi）“中等偏高”，這表明TG 497在臨床（chuáng）相關性上（shàng）更具優勢。

綜上所述（shù），TG 497不僅在科學性（xìng）能上更為出色，而且由於其不依賴動物實驗、與人（rén）體數（shù）據一致（zhì）性更高，因此得以成為目前首個被國際監管機構OECD采納的完全替代皮膚致敏性動物試驗的標準體外測試方案。這（zhè）一指南的頒布也標誌著毒理學替代方法從“輔助”邁入“決策級”應用的（de）關鍵進展。

盡管TG 497的成功被視（shì）為替代毒理學領域的重要裏程碑，但（dàn）其背後反映出的研發過程也暴露了動（dòng）物替代方法開發的諸多難點與局限。之所以能（néng）取得突破，首（shǒu）先因為皮膚致敏反應是目前有害結局通路建立最完善的毒（dú）理路徑之一，機製簡單、事件明確、模（mó）擬容易。相比之下，神經（jīng）毒性、免疫毒性、內分泌幹擾（rǎo）等終點路徑複雜，機製不明確，至今尚無可實現（xiàn）完全替代的體外組（zǔ）合方法。其次，TG 497研發（fā）成功的（de）核心優勢還在於擁有有（yǒu）大量來自因斑貼測試、臨床案例和職業暴露的人體皮膚致敏不良反應數（shù）據可用於方法驗證。而多數其它毒理領域仍嚴重依賴於動物實驗數據（jù），缺乏可比對的（de）人體資料，從而（ér）限製了相應替代方案的實（shí）際驗證路徑。即便如此，TG 497成功進入OECD指南也曆經了漫長（zhǎng）的驗證、標準化與（yǔ）互認過程。三項子方法最早提出可追溯至2006年前後，但直至（zhì）2015年才以單獨測試方法（fǎ）形式被 OECD 采納，2021年方整合為 TG497——整個流程耗時（shí）逾10年。

此外（wài）TG 497在皮膚致（zhì）敏評估中仍存在化學品適用範圍的盲區：它僅適用於小分子化學品，對金屬（shǔ）離子、複雜混合（hé）物、親（qīn）水性或高反應性物（wù）質尚（shàng）不適用（yòng）；同時，也不（bú）適用於易幹擾測試係統穩定性的強刺激性或腐蝕性（xìng）化合物。

可以說，TG497 的（de）誕生既是（shì）一道分（fèn）水嶺，也是一（yī）麵鏡子：一方麵，它首次證明“綜合測（cè）試方案”完全可（kě）以獲得監管層麵的認可，為 OECD 體係內其他毒理終點開發類似方法樹（shù）立了範式；另一方麵，它警示我們，唯有深入掌握（wò）生物機製、係統整合多源數據並實現方法標準化與多中心驗（yàn）證（zhèng），替代策（cè）略方能真正（zhèng）落地。更進一（yī）步，TG497 的成功表明（míng），替代路徑更適用於機製清晰、易於（yú）體外模擬且人體數據相對充足的毒理終點。總之，替（tì）代並非簡化，不是單憑熱情就可以“一蹴而就”的，而是在更高科學規範要求下（xià），通過持續演化與完善才能夠得以實現；同時，其研（yán）發仍離不開動物實驗與人體反（fǎn）應數據的對照（zhào）與支撐。因此，盡（jìn）管TG497 為全麵替（tì）代動物實驗（yàn）開了一個好頭，但在所有領域都實現（xiàn）這一目（mù）標仍（réng）有漫（màn）長的科學探索與製度建設之路要走。