滴（dī）眼給藥毒性試驗的目的

滴（dī）眼給藥（yào）毒性試驗（yàn）是重複給藥一般毒性（xìng）試驗，主要（yào）用於研發滴眼藥物。歐盟發布的《醫療用品非臨（lín）床局部耐受性試驗（yàn）指導原則（zé）》（CPMP/SWP, 2001）明確規定了（le）單次給藥和重複給藥眼（yǎn）部耐受性試驗的相關事宜。美國食品藥品監督管理局（jú）發布的《藥品（pǐn）以及可替代性給藥藥品非臨床安全性評價指導原則草案》（FDA/CDER, 2008）則明確要求在滴眼給藥時應開展（zhǎn）係統藥代動（dòng）力學（PK）和（hé）眼科檢查（包括裂隙（xì）燈顯微（wēi）鏡檢查、眼底檢查、眼壓測量及組織病理學檢（jiǎn）查）。然而，這兩份指導原則中的相關規定均較簡要（yào），缺乏滴眼給藥毒性試（shì）驗詳細設計的具體內容。目前，尚無滴眼給藥（yào）毒（dú）性試驗的確切定義。日本（衛生福利部，1999）依（yī）據ICH M3指導原則（ICH, 2009）和ICH S4指導原則開展滴眼給藥毒性試驗（yàn）。這些原則通常（cháng）適用於係統給藥的（de）藥物。

有人常常將滴眼給藥毒性試驗與眼刺激試驗混為一談。實際上，滴眼毒性預試驗、一周（zhōu）或兩（liǎng）周的重複給藥滴眼毒（dú）性試驗（yàn）的方案（àn）與（yǔ）眼刺激試驗的方案有相似之處（OECD, 2012）。

目前（qián），眼（yǎn）刺激試驗通常使用兔子進行，以評估化學物質在粘膜（mó）給藥或人體偶然接觸時的安全性（xìng）（OECD, 2012）。眼刺激試驗的主要目的是檢測眼表的刺激或腐（fǔ）蝕（shí）反應。

相比之下，滴眼（yǎn）給藥毒性試驗的（de）主要目的是評估眼科藥物（wù）的一般毒性。因此，滴眼給藥毒（dú）性試驗的檢查項目（mù）包括組織病理學檢查、眼部附屬器以及全身髒器的評價。這兩種試驗的差異見表1。

表（biǎo）1 滴眼給藥（yào）毒性試驗和眼刺激試驗的差異

滴眼給藥毒（dú）性試驗（yàn）的設計（jì）

01、動物（wù）物種

根據ICH M3指導原（yuán）則，一般毒性試（shì）驗需選擇兩種動物（ICH, 2009）。通常情況下，會從齧齒類（lèi）動物（如兔或小鼠）和非齧齒類（lèi）動物（犬或（huò）猴）中各選一種。然（rán）而，在過去十年間（2005~2016），經日本衛（wèi）生勞動福利部（MHLW）批準，約九成的滴眼液在研發過程中，將兔作為開展滴眼給藥毒性（xìng）試（shì）驗的首選實驗物種，其次常用的（de）實驗（yàn）物種是猴（幾乎全部是食蟹猴），再然後是犬（見表2）。因（yīn）此，滴眼給藥毒性試驗通常選（xuǎn）擇兩種（zhǒng）非（fēi）齧齒類動物。不過，動物物種的選擇是根據具體情況而定的。因此（cǐ），在評估某些藥物時，可能僅使用一個物種（zhǒng）（比如兔（tù）或食蟹（xiè）猴）。

表2 2005~2016日本滴眼液滴眼給（gěi）藥毒性試驗的獲批的動（dòng）物物種 

注：信息來源於日本醫藥和醫療器（qì）械局（PMDA）主頁

近（jìn）來發表的多篇文章從眼部安全性評（píng）估的角度出發，討論了各個實驗（yàn）物種的特點，並對不同實驗物種作了比較。各（gè）物種的特（tè）點如下。

兔

兔（tù）的眼（yǎn）球重量約為人眼（yǎn）的一半，眨眼頻率（每6分鍾一次）明顯低於人類的眨眼頻率（每5秒鍾一次）。此外，兔的角膜比人（rén）類（lèi）的角膜薄。基於這些（xiē）特點，並考慮到（dào）影響藥物角膜滲透能（néng）力的（de）因素（sù），有研究者預計，在滴入（rù）滴眼液後（hòu），兔眼的藥物暴露水平相對較（jiào）高。McDonald和（hé）Shadduck（1977）認為兔相較於其他實驗動物對眼刺激物更（gèng）為敏（mǐn）感。使（shǐ）用兔（tù）進（jìn）行試（shì）驗的其（qí）他原因還包括（kuò）較低的（de）動物成本以及基於大量供試品積累的曆（lì）史數據。

在進行滴眼給藥毒性試（shì）驗時，特別需（xū）注意選擇色素兔還是白化兔。由於供試品能夠與色素兔體（tǐ）內的色素結合，因此在毒性評估時，色素兔（tù）更具優（yōu）勢。關於色素兔，荷蘭帶兔比（bǐ）新西蘭大白兔和新西蘭紅兔（F1代兔（tù））更常用於滴眼給藥毒性試（shì）驗。Durairaj等人（2012）報（bào）告（gào）稱，人（rén）、食蟹猴、犬、豬、F1代兔和荷蘭帶兔的眼部黑色素含量存在差異，而且（qiě）不同物種之間眼睛各部分的（de）黑色素含量也不同。另外，值得一（yī）提的是，荷蘭帶兔的眼球比新西蘭（lán）大白兔或日本白兔的小。

猴

盡管食（shí）蟹猴的眼球重量僅約為人眼的一半，但其解剖特征與人類相似。例如（rú），食蟹猴的角膜和晶狀體相對較小，眼底有（yǒu）黃斑。Shibuya等人（2015）建議將食蟹猴用作實驗動物，因為它們的眼（yǎn）睛有助於詳細評估藥物誘導（dǎo）的黃斑病變毒性。食蟹猴的眨眼頻率與人類相似。與人類一樣，食蟹猴既沒有瞬膜，也沒有哈氏腺（xiàn），而兔、犬和豬則都有瞬（shùn）膜和哈氏腺。食蟹猴和犬一樣，也用於（yú）係統（tǒng）毒性試驗。利用相關物種可以（yǐ）獲得毒理學數據，彌合局部給藥和係統給藥在同一物種中產生的結（jié）果差異。與人類相比，食蟹猴的（de）眼（yǎn）組織黑色素含量相對較高。在猴類中，視神經退化常見（jiàn）於恒河猴和食蟹（xiè）猴，且（qiě）被（bèi）認為是自發性先天視神經（jīng）病變。

犬和豬

針對特定目（mù）的飼養的比格犬的眼球重量約為5.5克，約為人眼重量的0.8倍，而豬的眼球大小接（jiē）近人眼。從眼球的絕對尺寸來看，犬和豬在藥物局部效應評估方麵具有優勢，因為眼組織的厚度和長度是決定局部給（gěi）藥藥（yào）物（wù）滲透性和分布的重要因素。犬和豬的眼（yǎn）部解剖特（tè）征（zhēng）相似，例如，與靈（líng）長類動（dòng）物相（xiàng）比，它們的晶狀體在眼球中（zhōng）占據的體積（jī）相對較大。另一方麵，犬的脈絡膜上有（yǒu）毯氈層，而豬、兔或食蟹猴則沒有。目前，犬和豬不常用於滴（dī）眼給藥毒性試驗，尤（yóu）其是豬。然而，這類動物（wù）在滴眼給藥毒性試驗中仍有其獨特的優勢，理由如下：1. 基於上述解剖和（hé）生理特點，模仿人體藥物分布的可能性較高。2. 與兔（tù）和食蟹（xiè）猴相比，由於犬和豬的體型相對較大，通過係（xì）統給藥出現的藥物反應更少。

02、性別（bié）

根據一般毒性（xìng）試驗指導（dǎo）原則（衛生（shēng）福利部，1999），滴眼給藥毒性試（shì）驗應在（zài）兩種性別的（de）動物（wù）上進行。人類、恒河猴和兔的眼軸長度存在性別差異，但眼球尺寸的性別差異卻極其（qí）微小。Wagner等人（2008）研究了健康人眼和患病（bìng）人眼（yǎn）的性別差異，認為性激素影響了不同（tóng）性別在患（huàn）病狀態下的淚（lèi）腺係統、眼瞼和眨眼頻率、以及角膜的解（jiě）剖和（hé）特征。一（yī）般而言（yán），幹眼（yǎn）流行病學研究（jiū）表明女性（xìng）幹眼發病率比男性（xìng）高。然而，實驗動物的眼睛（jīng）是否存在顯著的（de）性別差異尚（shàng）不明確。是否在滴眼給藥毒性試驗中使用兩種性（xìng）別，尤其僅進行眼毒性評估的試驗，仍有（yǒu）待進一步討論。

03、給藥

劑量和（hé）濃度

根據ICH M3指導原則（ICH，2009），一般（bān）毒性試（shì）驗的高劑量水平設定（dìng）為最大耐受量（MTD）、最大（dà）給藥量（MFD）或人體（tǐ）暴露量的（de）50倍。這一設定原則同樣適用於滴眼（yǎn）給藥毒（dú）性（xìng）試（shì）驗。在某些情況下，高劑（jì）量水（shuǐ）平可（kě）以基於局部耐受（shòu）性預試驗的結果（guǒ）來確定。然而，在大多數情（qíng）況下，滴眼給藥毒性（xìng）試驗的高劑量水平（píng）是根據MFD設定的，主要是由於製（zhì）劑製備的某些內在因素。

供試（shì）品的角膜滲透性主要取（qǔ）決於製劑的特性。為了獲得有意義的風險評（píng）估（gū）結果，權（quán）威性滴眼給藥毒性試驗（例如首次人（rén）體試驗之前（qián）開展的GLP試驗）所用的（de）供試製劑應與臨床試驗所用的製劑一致或相（xiàng）近。供試（shì）品的濃度主要是根據其在製（zhì）劑中的溶解度來定義的。至於製劑的調整，其他特性（xìng）（如滲透壓（yā）、pH值和賦形劑）也（yě）十分重要。滴眼液製劑（jì）的酸堿度應在可接受的生理範圍內。選擇防腐劑時，需避（bì）免其（qí）濃度達（dá）到引起毒性反應的水平。例如，有研究者發現，眼科製劑中常用（yòng）的防腐劑苯紮氯銨在局部給藥時會誘發角膜變化。因此，眼（yǎn）科製劑中防腐劑的濃度是有限製（zhì）的。因此（cǐ），在大（dà）多數情況下，滴眼給藥毒性試驗所設的最高劑量水平是基於受試製劑（jì）的最大給（gěi）藥量，而非供試品本（běn）身的特性來決定的。

滴眼體積

兔子的眼（yǎn）瞼較為鬆弛，結膜囊較大，因此能容納較大的（de）滴眼液（yè）體積。根據OECD眼刺激試驗指導原則（zé），兔子的滴眼體（tǐ）積為0.1 mL（OECD, 2012）。該體積（jī）約（yuē）為臨床標準滴眼液用藥體積（jī）（約0.04 mL）的兩倍（bèi）。從經驗來看，不同物種的最大滴眼體積並不相同。例如，比格犬和兔（tù）子的最大可行體積相似（sì），而食蟹猴的最（zuì）大可行體（tǐ）積則是比格（gé）犬和（hé）兔子的兩倍多。

需注意的是，眼部暴露量並不會隨著滴眼體積的增加而成比例增加（jiā），因為部分多餘的液體會通過鼻淚管（guǎn）流失。Lambert等（1993）假定（dìng）在眼刺激試驗中，如（rú）果滴眼體積為0.01 mL（建議供試體積的（de）十分（fèn）之一），藥物與人眼刺激感受的相關性更（gèng）佳。因此，滴眼給藥毒性試驗的滴眼（yǎn）體積可能需進一（yī）步討（tǎo）論。增加滴眼（yǎn）體積並不能有效提（tí）高眼部暴露量（liàng），反而可能導致係（xì）統暴露量增加，甚至引發意料之外的係（xì）統毒性反應。

單眼/雙眼給藥

供試品是單（dān）眼給藥還是雙眼給藥需慎重考慮（lǜ）。從動物福利的角度出發，若無特殊原因，應將供試品滴入單側眼睛。如一隻眼給予供試品，另一隻眼則不給藥（即不接觸供試品），或給予對照品（例如溶媒製劑）作為對（duì）照。然而，嚴格來（lái）說，對照眼由於係（xì）統循環的影響，可能也會（huì）接觸到供試品。因此，在評估對照眼的結果時，應該考（kǎo）慮（lǜ）到這一潛在的接觸因素。

給藥頻率

在標準的口（kǒu）服或靜脈給藥一般毒性試驗中，通常每天給（gěi）藥一次；而在滴眼給（gěi）藥毒（dú）性試（shì）驗中，通常一天給藥多（duō）次（cì）。非臨床（chuáng）試驗的滴眼頻率通常高於（yú）臨床試驗的給藥頻率。例如，非臨床試驗中可能每天滴眼4次，而臨床試驗中則每天滴眼2次。滴眼給藥毒性試驗設定較高的給藥頻（pín）率（lǜ），旨在獲得更高的重複暴露量（liàng），特（tè）別是在（zài）供試品的生化特征導致（zhì）最大藥物濃度難以增加時更（gèng）為重（chóng）要。Chrai等（děng）人（1974）報告稱，如果兩次滴眼間隔5分鍾，就（jiù）能有效（xiào）地增加兔的眼部暴露量。許多滴眼（yǎn）給藥毒性試（shì）驗（yàn）的給藥頻率是臨床給藥頻率的1.5到2倍。然而，給藥過於頻繁雖可提高（gāo）暴露水平（píng），但（dàn）也增加操作的次數，從而增（zēng）加動（dòng）物保定的頻率，這可能導致動物應激，進而引發倫理問（wèn）題（tí）。因此，在設計滴眼給藥毒性試驗時，需在提高暴露水平和減少動物應激之間找（zhǎo）到平衡點，以確保試驗的科學性和倫（lún）理性。

04、眼及附屬組織檢查

常規/標準眼科學檢查

滴眼給藥毒性試驗目前尚無統一的眼部和係統檢查項目（mù）。OITSs的眼（yǎn）科學檢查是基於係統藥物一（yī）般毒性評估指導原則進行的，涵（hán）蓋了眼前節、眼內（nèi）介質和眼底等（děng）所有組織的檢查（ICH, 1999）。然而（ér），由（yóu）於滴眼給藥直接（jiē）作用於眼部，滴眼給（gěi）藥毒性（xìng）試驗的眼科學檢查更加詳細，涵蓋的檢查項目也更（gèng）多。Weir和Wilson（2013）列出了非臨床眼毒性試驗（yàn）的標準眼部安全性終（zhōng）點，這些終點具有重要的借鑒意義。檢查（chá）項（xiàng）目包括（kuò）：大體觀察、裂隙燈生物顯微鏡檢查、眼底檢眼鏡檢查、眼壓測量（liàng）、視（shì）網膜電圖（tú）和組織病理學。

基於相關指導原則和知識，表3總結了（le）滴眼給藥毒性試驗的常規及可選眼科（kē）檢（jiǎn）查項目。由於眼前（qián）節的（de）供（gòng）試品濃度較高，因此對眼前節進行觀察和檢查尤為重要。除標準的大體觀察外，采用評分方法進行詳細觀察對於評估（gū）眼毒性的嚴（yán）重程度非（fēi）常關鍵。例如，Draize評分法用於角膜、虹膜和結膜的大體觀察。McDonald Schadduck評（píng）分和Hackett-McDonald評分常應用於滴眼給藥毒性試驗中，二（èr）者對裂隙燈顯微鏡（jìng）檢查（chá）結果進行評分。特別是，Hackett-McDonald評（píng）分能對眼睛進行全麵評估，包括對晶體和瞳孔光反射的評估。

表3 滴眼給藥毒性試驗的常規或可選眼科學檢查

常規檢查包括利用（yòng）檢眼鏡對玻璃（lí）體和眼底進行觀察。使用直接（jiē）檢眼鏡（jìng）和間接檢眼鏡（jìng）可詳細檢查眼底。本原則建議（yì），除拍照（zhào）外，還應簡述檢查結果並記錄，並（bìng）將這些記錄（lù）與相應的詳細（xì）記錄一同（tóng）保存。

眼壓是衡（héng）量前房角功能變化的重要參（cān）數。FDA指導原則（zé）提到了使用（yòng）眼壓計的（de）方法（FDA/CDER，2008）。在非臨床毒性試驗中，常用扁平眼（yǎn）壓計、回彈式眼壓計或空（kōng）氣（qì）式眼壓計來（lái）測量眼壓（yā）。在滴眼給藥毒（dú）性試驗中，使用眼壓計有幾點注意事項。首先，為了（le）獲得準（zhǔn）確的眼壓（yā）值（zhí），有必（bì）要使動物適（shì）應眼壓計（jì）。在測量之前，如果動物沒有（yǒu）適（shì）應眼壓計，通常情況下測出的眼壓值會偏高，從（cóng）而導致無法正確判斷藥效。其次，由於（yú）儀器會接觸角膜表麵，眼壓測量操作可能會在某種程度上損傷角膜（mó）上皮細胞。因（yīn）此，應慎重決（jué）定檢查的組別及檢查順序，以避免眼部過度應激，並防止過度應激影響其他結果的解讀。

通過全視野視網（wǎng）膜電（diàn）圖檢查（ffERG）可檢（jiǎn）測視網膜的功（gōng）能變化。理想的做法是使用（yòng）國際臨床視覺電生理（lǐ）協（xié）會（ISCEV）建議的方（fāng）法，因為此方法可在進行全視野視網膜電圖檢查時識別視錐細胞和視杆細胞的（de）變化。然而，此方法不適（shì）用於在（zài）有限時間內對大（dà）量（liàng）動物進行檢查的情況。ISCEV方法擬用於隨診檢查，可能僅適（shì）用於（yú）ERG檢查發現異常的情況。例（lì）如，Penha等人（2010）報（bào）告稱，角（jiǎo）膜混濁或（huò）晶體混濁（zhuó）會影響光線到達視（shì）網膜，而麻醉也會影響全視野視網膜電（diàn）圖的檢查結果。

可選檢查

關於淚膜檢查，Schirmer試驗和酚紅線試驗用於（yú）淚液體積的定（dìng）量分析。進行Schirmer試驗和酚紅線試驗時，分別使用無毒濾紙（zhǐ）或棉線浸（jìn）潤於pH指示劑酚紅溶液中，然後插入結膜囊內進（jìn）行淚膜檢測。淚膜的其他臨床檢查包括淚（lèi）膜破（pò）裂時（shí）間。此前已有研究者報告了犬和（hé）兔的淚（lèi）膜（mó）破裂時間（jiān），這些測試能夠揭示淚腺（xiàn）的功能狀態。此外，眨眼頻率也可以間接說明供試品是否對角膜產生了刺激。

由於眼科成像技術的進（jìn）步，現在能檢測出常規眼科學檢查難以察覺的變化。例如，角膜共焦（jiāo）顯微鏡檢查能夠捕捉到角膜上皮的細（xì）微變（biàn）化；角膜內皮顯微鏡檢查能夠觀察到角（jiǎo）膜內皮的形態（tài）和密度變化；光學相幹斷層掃描（OCT）對於視網膜的觀察非常有力。這些成像技術均可用於滴眼給藥毒性試驗中的動物檢查，能夠生成高分辨率的圖像，滿足組織病理學檢查的要求。

滴眼給藥毒性試驗的其他常用（yòng）眼前節檢查包括定（dìng）量測量角膜厚度的測厚儀和定量測（cè）量前房房水閃輝的激光房水閃光細胞儀。如果眼後節的視網膜出現局部異常，多焦視網膜電圖（tú）（mfERG）能夠捕捉到相應的電生理信號。利用眼底血管熒光造影能夠觀察到視（shì）網膜和脈絡膜的（de）原有血管及（jí）新（xīn）生血管的滲透性。

Kontadakis等人（2014）指出，淚膜中的細胞因子和生長因子作為（wéi）生物標記物（wù），能預示眼（yǎn）表疾病。有研究者報告（gào）稱，血清細胞因（yīn）子是預示老年黃斑變（biàn）性的生物標（biāo）記物（wù）。生物（wù）標記物能用於非侵入性方式觀察藥物誘導的眼毒性反應。然（rán）而（ér），目前這樣的生物標記物數量仍然有限。反過來，上述的各（gè）種（zhǒng）眼部成（chéng）像技術可能可替代生物標記物，用於觀察和研究人和動物的眼毒（dú）性。

05、眼及附屬組織的病理學檢查

組織病理檢查是滴眼給藥（yào）毒性試驗的重要組成部分。最近，多篇文獻綜述一致強調了組織病理學檢查在藥物評估中的重（chóng）要性（xìng）。在滴眼給藥（yào）毒性試驗中（zhōng），供試品的最大暴（bào）露量不僅出現在角膜上皮，還出現（xiàn）在結膜和排（pái）泄係統，包括鼻淚管的粘膜和鼻腔。因此，需要特別注意細致檢查這些組織。淚腺、哈氏腺（若有）、鼻腔和瞬膜（若有）也（yě）應進行（háng）組織病理學檢查。為了準確地進（jìn）行組織病理學評估分析，必須嚴格考量組織病理切片的質（zhì）量。如（rú）今已有多（duō）篇關於這一（yī）方麵的文章發（fā）表，詳（xiáng）細（xì）闡述了切片（piàn）的各種技術考量。